Ovaj prvi slučaj genetske manipulacije kod guštera stvorio je model organizma koji bi mogao pomoći u daljnjem razumijevanju evolucije i razvoja gmazova
CRISPR-Cas9 ili jednostavno CRISPR je jedinstven, brz i jeftin gen alat za uređivanje koji omogućuje uređivanje genoma brisanjem, dodavanjem ili izmjenom DNA. CRISPR akronim znači 'Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats'. Ovaj alat je jednostavan i precizniji od prethodnih metoda korištenih za uređivanje DNA.
Alat CRISPR-Cas9 ubrizgava organizme u fazi zigote (jednostanične) s DNK konstruktom napravljenim od (a) enzima Cas9 koji djeluje kao 'škare' i može izrezati ili izbrisati dio DNK, (b) voditi RNA – sekvencu koja odgovara ciljnom genu i tako vodi Cas9 enzim do ciljanog mjesta. Nakon što je ciljni dio DNK izrezan, stanični strojevi za popravak DNK ponovno će se spojiti s preostalom lancunom i, u tom procesu, utišati ciljani gen. Ili bi se gen mogao 'ispraviti' korištenjem novog modificiranog DNK predloška u procesu koji se naziva popravak usmjeren na homologiju. Dakle, CRISPR-Cas9 alat omogućuje genetske modifikacije ubrizgavanjem uređivanje gena otopine u jednostanično oplođeno jaje. Ovaj proces uzrokuje genetsku promjenu (mutaciju) u svim sljedećim stanicama koje nastaju i tako utječu na funkciju gena.
Iako se CRISPR-Cas9 rutinski koristi u mnogim vrstama uključujući ribe, ptice i sisavce, do sada nije bio uspješan u genetskoj manipulaciji gmazovima. To je prvenstveno zbog dvije prepreke. Prvo, ženke gmazova pohranjuju spermu dugoročno u svom jajovodu što otežava određivanje točnog vremena oplodnje. Drugo, fiziologija jaja gmazova ima mnogo značajki kao što su savitljive ljuske jaja, krhkost bez zračnog prostora unutar koje je teško manipulirati embrijima bez izazivanja puknuća ili oštećenja.
U članku učitanom na bioRxiv 31. ožujka 2019. istraživači su izvijestili o razvoju i testiranju načina korištenja CRISPR-Cas9 uređivanje gena kod gmazova prvi put. Vrsta gmazova odabrana u studiji bila je tropska gušter zvan Anolis sagrei ili češće smeđi anol koji je rasprostranjen na Karibima. Gušteri u studiji prikupljeni su iz divlje regije na Floridi, SAD. Ova je vrsta idealno prikladna za istraživanje zbog svoje minijaturne veličine, duge sezone razmnožavanja i relativno kratkog prosječnog vremena između dvije generacije.
Kako bi prevladali ograničenja s kojima se trenutno suočavaju gmazovi, istraživači su mikroinjektirali komponente CRISPR-a u nezrela neoplođena jajašca dok su jaja još bila u jajnicima ženki guštera prije oplodnje. Oni su ciljali gen tirozinaze koji proizvodi enzim koji kontrolira pigmentaciju kože kod guštera i ako se taj gen ukloni gušter bi se rodio kao albino. Ovaj jasan pigmentacijski fenotip bio je razlog za odabir gena za tirozinazu. Mikroinjektirana jajašca tada sazrijevaju unutar ženke i nakon toga se prirodno oplođuju unesenom muškom ili pohranjenom spermom.
Kao rezultat toga, četiri albino guštera rođena su nekoliko tjedana kasnije, što potvrđuje da je gen tirozinaze deaktiviran i uređivanje gena proces je bio uspješan. Budući da su potomci sadržavali uređeni gen oba roditelja, bilo je jasno da su komponente CRISPR-a ostale aktivne puno dulje u majčinoj nezreloj jajnoj ćeliji i da su nakon oplodnje mutirale očeve gene. Stoga su mutirani albino gušteri pokazali manipuliranu tirozinazu u genima naslijeđenima i od majke i od oca jer je albinizam osobina naslijeđena od oba roditelja.
Ovo je prva studija koja učinkovito proizvodi genetski modificirane gmazove. Istraživanje bi moglo funkcionirati na sličan način i na drugim vrstama guštera poput zmija za koje su dosadašnji pristupi dosad bili neuspješni. Ovaj bi rad mogao pomoći u daljnjem razumijevanju evolucije i razvoja gmazova.
***
{Ova je studija trenutačno poslana na recenziju. Možete pročitati verziju za prettisak klikom na vezu DOI koja se nalazi u nastavku na popisu citiranih izvora}
Izvor (i)
Rasys AM i sur. 2019. Pretisak. CRISPR-Cas9 Uređivanje gena kod guštera mikroinjektiranjem neoplođenih jajnih stanica. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
