Kako analize lipida otkrivaju drevne prehrambene navike i kulinarske prakse

Chromatography and compound specific isotope analysis of lipid remains in ancient pottery tell a lot about ancient hrana habits and culinary practices. In the last two decades, this technique has successfully been employed to unravel ancient hrana practices of several archaeological sites in the world. Researchers have applied this technique recently to the potteries collected from multiple archaeological sites of Indus Valley Civilisation. The key scientific finding was dominance of non-ruminant fats in the cooking vessels implying non-ruminant animals (such as horse, pigs, poultry, fowl, rabbit, etc) were cooked in the vessels over a long period. This contradicts the long held view (based on faunal evidence) that ruminant animals (such as cattle, buffalo, deer,etc) were consumed as hrana by Indus Valley people.  

Archaeological excavations of important sites in the past century provided lot of information about the culture and practices of ancient people. However, understanding diet and subsistence practices prevalent in ancient prehistoric societies with no written records used to be an uphill task because not much of what constituted ‘food’ were left due to almost complete natural degradation of hrana and biomolecules. In the last two decades, the standard chemical techniques of chromatography and compound specific analysis of the ratio of stable isotopes of carbon have made inroads in archaeological studies enabling researchers to pinpoint sources of lipids. As a result, it has become possible to investigate diet and subsistence practices using molecular and isotopic analyses of absorbed food residues based on the δ13C and Δ13C values.  

Plants are the primary producers of food. Most plants use C3 photosynthesis to fix carbon, hence are called C3 plants. Wheat, barley, rice, oats, rye, cowpea, cassava, soybean etc are the main C3 plants. They form the staple hrana of mankind. C4 plants (such as corn, sugarcane, millet, and sorghum) on the other hand, use C4 photosynthesis for carbon fixation.  

Carbon has two stable isotopes, C-12 and C-13 (the third isotope C-14, is unstable hence radioactive and is used for dating organski archaeological finds). Of the two stable isotopes, the lighter C-12 is preferentially taken up in photosynthesis. Photosynthesis is not universal; it favours fixation of C-12. Further, C3 plants take up lighter C-12 isotope more than C4 plants do. Both C3 and C4 plants discriminate against heavier C-13 isotope but C4 plants do not discriminate as heavily as C3 plants. Put conversely, in photosynthesis, both C3 and C4 plants favour C-12 isotope over C-13 but C3 plants favours C-12 more than C4 plants. This results in differences in ratio of stable isotopes of carbon in C3 and C4 plants and in animals that feed on C3 and C4 plants. An animal fed on C3 plants will have more of lighter isotopes than an animal fed on C4 plants meaning a lipid molecule with lighter isotope ratio is more likely to have originated from an animal fed on C3 plants. This is the conceptual basis of compound specific isotope analysis of lipid (or any other biomolecule for that matter) that helps in identifying sources of lipid residues in the pottery. In a nutshell, C3 and C4 plants have different carbon isotopic ratios. The δ13C value for C3 plants is lighter between −30 and −23‰ while for C4 plants this value is between −14 and −12‰. 

Nakon ekstrakcije lipidnih ostataka iz uzoraka keramike, prvi ključni korak je odvajanje različitih lipidnih sastojaka tehnikom plinske kromatografije-masene spektrometrije (GC-MS). To daje lipidni kromatogram uzorka. Lipidi se s vremenom razgrađuju pa ono što obično nalazimo u starim uzorcima su masne kiseline (FA), posebno palmitinska kiselina (C₁₆) i stearinska kiselina (C₁₈). Dakle, ova tehnika kemijske analize pomaže u identifikaciji masnih kiselina u uzorku, ali ne daje informacije o podrijetlu masnih kiselina. Potrebno je dodatno utvrditi je li određena masna kiselina identificirana u drevnoj posudi za kuhanje potjecala iz mliječnih proizvoda ili životinjskog mesa ili biljaka. Ostaci masnih kiselina u posudama ovise o tome što se u davnim vremenima kuhalo u posudi. 

Biljke C3 i C4 imaju različite omjere stabilnih izotopa ugljika zbog preferencijalnog unosa lakšeg izotopa C12 tijekom fotosinteze. Slično tome, životinje hranjene C3 i C4 biljkama imaju različite omjere, na primjer, domaća goveda (preživači poput krava i bivola) hranjena hranom C4 (kao što je proso) imat će drugačiji omjer izotopa od manjih domaćih životinja poput koza, ovaca i svinje koje obično pasu i uspijevaju na biljkama C3. Nadalje, mliječni proizvodi i meso dobiveni od goveda preživača imaju različite omjere izotopa zbog razlika u sintezi masti u njihovoj mliječnoj žlijezdi i masnom tkivu. Utvrđivanje podrijetla određene ranije identificirane masne kiseline vrši se analizom omjera stabilnih izotopa ugljika. Tehnika masene spektrometrije plinske kromatografije-izgaranja-omjera izotopa (GC-C-IRMS) koristi se za analizu omjera izotopa identificiranih masnih kiselina.   

Važnost analize omjera stabilnih izotopa ugljika u lipidnim ostacima u arheološkim studijama pretpovijesnih nalazišta pokazana je 1999. godine kada je studija arheološkog nalazišta u Welsh Borderlands, UK, mogla napraviti jasnu razliku između masti nepreživača (npr. svinja) i podrijetlom od preživača (npr. ovaca ili goveda).¹. Ovaj bi pristup mogao pružiti uvjerljiv dokaz prve proizvodnje mlijeka u zelenoj Saharskoj Africi u petom tisućljeću pr. Sjeverna Afrika tada je bila zelena od vegetacije i pretpovijesni saharski afrički ljudi usvojili su praksu proizvodnje mlijeka. To je zaključeno na temelju vrijednosti δ13C i Δ13C glavnih alkanskih kiselina mliječne masti identificiranih u keramičkim posudama². Slične analize pružile su najranije izravne dokaze o preradi i konzumaciji mliječnih proizvoda u pastirskim neolitskim društvima u istočnoj Africi³ i u ranom željeznom dobu, sjeverna Kina⁴. 

U južnoj Aziji, dokazi o pripitomljavanju datiraju iz 7^th tisućljeće pr. do 4^th millennium BC, domesticated animals like cattle, buffalo, goat, sheep etc were present across various Indus Valley sites. There were suggestions of utilisation of these animals in food for dairy and meat but no conclusive scientific evidence to support the view. Stable isotope analysis of lipid residue extracted from ceramic shreds collected from Dolina Inda settlements provide the earliest direct evidence of dairy processing in South Asia⁵. U još jednoj nedavnoj, detaljnijoj, sustavnoj studiji ostataka lipida iz fragmenata posuda prikupljenih s više lokacija u dolini Inda, istraživači su pokušali utvrditi vrstu namirnica korištenih u posudama. Analiza izotopa potvrdila je upotrebu životinjskih masti u posudama. Ključno znanstveno otkriće bila je dominacija masti nepreživača u posudama za kuhanje⁶ što podrazumijeva životinje koje nisu preživači (kao što su konj, svinja, perad, perad, kunić, itd.) kuhane su u posudama tijekom dugog razdoblja i konzumirane kao hrana. Ovo je u suprotnosti s dugotrajnim mišljenjem (temeljenim na dokazima faune) da su preživače (kao što su goveda, goveda, bivoli, jeleni, koze itd.) ljudi iz doline Inda jeli kao hranu.  

Nedostupnost lokalnih suvremenih referentnih masti i mogućnost miješanja biljnih i životinjskih proizvoda ograničenja su ove studije. Kako bi se prevladali mogući učinci koji proizlaze iz miješanja biljnih i životinjskih proizvoda, te za holistički pogled, analiza škrobnih zrna uključena je u analizu ostataka lipida. Ovo je podržavalo kuhanje biljaka, žitarica, mahunarki itd. u posudi. Ovo pomaže u prevladavanju nekih ograničenja⁷. 

*** 

Reference:  

1. Dudd SN dr. 1999. Dokazi za različite obrasce iskorištavanja životinjskih proizvoda u različitim pretpovijesnim tradicijama keramike na temelju lipida sačuvanih na površini i apsorbiranih ostataka. Vjesnik za arheološke znanosti. Svezak 26, broj 12, prosinac 1999., stranice 1473-1482. DOI: https://doi.org/10.1006/jasc.1998.0434 

2. Dunne, J., Evershed, R., Salque, M. i sur. Prva proizvodnja mlijeka u zelenoj Saharskoj Africi u petom tisućljeću pr. Nature 486, 390–394 (2012). DOI: https://doi.org/10.1038/nature11186 

3. Grillo KM et al 2020. Molekularni i izotopski dokazi za mlijeko, meso i biljke u pretpovijesnim stočarskim sustavima ishrane istočne Afrike. PNAS. 117 (18) 9793-9799. Objavljeno 13. travnja 2020. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1920309117 

4. Han B., dr. 2021. Analiza lipidnih ostataka keramičkih posuda s nalazišta Liujiawa u RuiStateu (starije željezno doba, sjeverna Kina). Journal of Quaternary Science (2022) 37 (1) 114–122. DOI: https://doi.org/10.1002/jqs.3377 

5. Chakraborty, KS, Slater, GF, Miller, H.ML. et al. Analiza lipidnih ostataka specifičnih izotopa spojeva pruža najranije izravne dokaze o preradi mliječnih proizvoda u Južnoj Aziji. Sci Rep 10, 16095 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-72963-y 

6. Suryanarayan A., dr. 2021. Ostaci lipida u keramici iz civilizacije Inda u sjeverozapadnoj Indiji. Vjesnik za arheološke znanosti. Svezak 125, 2021,105291, XNUMX. DOI:https://doi.org/10.1016/j.jas.2020.105291 

7. García-Granero Juan José, dr. 2022. Integriranje analiza zrna lipida i škroba iz keramičkih posuda za istraživanje pretpovijesnih prehrambenih putova u sjevernom Gujaratu, Indija. Granice u ekologiji i evoluciji, 16. ožujka 2022. Sec. Paleontologija . DOI: https://doi.org/10.3389/fevo.2022.840199 

Bibliografija  

1. Irto A., dr. 2022. Lipidi u arheološkoj keramici: pregled tehnika uzimanja uzoraka i ekstrakcije. Molecules 2022, 27(11), 3451; DOI: https://doi.org/10.3390/molecules27113451 

2. Suryanarayan, A. 2020. Što se kuha u civilizaciji Inda? Istraživanje induske hrane analizom keramičkih lipidnih ostataka (doktorski rad). Sveučilište u Cambridgeu. DOI: https://doi.org/10.17863/CAM.50249 

3. Suryanarayan, A. 2021. Predavanje – Ostaci lipida u keramici iz civilizacije Inda. Dostupno u https://www.youtube.com/watch?v=otgXY5_1zVo 

***